高效液相色譜法的原理、儀器要求、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及測(cè)定方法！
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高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，對(duì)供試品進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。注入的供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測(cè)器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號(hào)。
（一）對(duì)儀器的一般要求和色譜條件所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應(yīng)定期檢定并符合有關(guān)規(guī)定。
（1）色譜柱反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等）也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統(tǒng)使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統(tǒng)使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對(duì)映異構(gòu)體的分離通常使用手性填充劑。
填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。分析分子量小于2000的化合物應(yīng)選擇孔徑在15nm（1nm=10?）以下的填料，分析分子量大于2000的化合物則應(yīng)選擇孔徑在30nm以上的填料。除另有規(guī)定外，普通分析柱的填充劑粒徑一般在3～10μm之間，粒徑更?。s2μm）的填充劑常用于填裝微徑柱（內(nèi)徑約2mm）?。使用微徑柱時(shí)，輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測(cè)池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。當(dāng)對(duì)其測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生爭(zhēng)議時(shí)，應(yīng)以品種項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件的測(cè)定結(jié)果為準(zhǔn)。以硅膠為載體的鍵合固定相的便用溫度通常不超過(guò)40℃，為改善分離效果可適當(dāng)提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過(guò)60℃。
流動(dòng)相的pH值應(yīng)控制在2～8之間。當(dāng)pH值大于8時(shí)，可使載體硅膠溶解；當(dāng)pH值小于2時(shí)，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當(dāng)色譜系統(tǒng)中需使用pH值大于8的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化填充劑或非硅膠基鍵合填充劑等；當(dāng)需使用pH值小于2的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護(hù)作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑、有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化填充劑等。
（2）檢測(cè)器：最常用的檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，包括二極管陣列檢測(cè)器，其他常見(jiàn)的檢測(cè)器有熒光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器等。
紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器為選擇性檢測(cè)器，其響應(yīng)值不僅與供試品溶液的濃度有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和示差折光檢測(cè)器為通用型檢測(cè)器，對(duì)所有的化合物均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物，其響應(yīng)值幾乎僅與供試品的質(zhì)量有關(guān)；二極管陣列檢測(cè)器可以同時(shí)記錄供試品的吸收光譜，故可用于供試品的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。
紫外、熒光、電化學(xué)和示差折光檢測(cè)器的響應(yīng)值與供試品溶液的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的響應(yīng)值與供試品溶液的濃度通常呈指數(shù)關(guān)系，故進(jìn)行計(jì)算時(shí)，一般需經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。不同的檢測(cè)器，對(duì)流動(dòng)相的要求不同。如采用紫外檢測(cè)器，所用流動(dòng)相應(yīng)符合紫外-可見(jiàn)分光光度法項(xiàng)下對(duì)溶劑的要求；采用低波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，還應(yīng)考慮有機(jī)相中有機(jī)溶劑的截止使用波長(zhǎng)，并選用色譜級(jí)有機(jī)溶劑。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器通常不允許使用含不揮發(fā)性鹽組分的流動(dòng)相。
（3）流動(dòng)相：反相色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相首選甲醇-水系統(tǒng)（采用紫外末端波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，首選乙腈-水系統(tǒng)）?，如經(jīng)試用不適合時(shí)，再選用其他溶劑系統(tǒng)。應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動(dòng)相，必須使用時(shí)，應(yīng)盡可能選用含較低濃度緩沖液的流動(dòng)相。由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對(duì)于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例通常應(yīng)不低于5%，否則C18鏈的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。
各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動(dòng)相組分、檢測(cè)器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)供試品并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。其中，調(diào)整流動(dòng)相組分比例時(shí)，以組分比例較低者（小于或等于50%）相對(duì)于自身的改變量不超過(guò)±30%且相對(duì)于總量的改變量不超過(guò)±10%為限，如30%相對(duì)改變量的數(shù)值超過(guò)總量的10%時(shí)，則改變量以總量的±10%為限。
對(duì)于必須使用特定牌號(hào)的填充劑方能滿足分離要求的品種，可在該品種項(xiàng)下注明。
（二）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)通常包括理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子等4個(gè)參數(shù)。其中，分離度和重復(fù)性尤為重要。按各品種項(xiàng)下要求對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對(duì)照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，必要時(shí)，可對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以符合要求。
（1）色譜柱的理論板數(shù)（n）用于評(píng)價(jià)色譜柱的分離效能。由于不同物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì)，一般為待測(cè)組分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的理論板數(shù)。在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間tR（以分鐘或長(zhǎng)度計(jì)）和峰寬（W）或半高峰寬（Wh/2）?，按n=16（tR/W）2或n=5.54（tR/Wh/2）2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。
（2）分離度（R）?：用于評(píng)價(jià)待測(cè)組分與相鄰共存物或難分離物質(zhì)之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關(guān)鍵指標(biāo)。可以通過(guò)測(cè)定待測(cè)物質(zhì)與已知雜質(zhì)的分離度、也可以通過(guò)測(cè)定待測(cè)組分與某一添加的指標(biāo)性成分（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)或其他難分離物質(zhì)）的分離度，或?qū)⒐┰嚻坊驅(qū)φ掌酚眠m當(dāng)前方法降解，通過(guò)測(cè)定待測(cè)組分與某一降解產(chǎn)物的分離度舉對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)與控制。無(wú)論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測(cè)峰與其他峰、內(nèi)標(biāo)峰或特定的雜質(zhì)對(duì)照峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外，待測(cè)組分與相鄰共存物之間的分離度應(yīng)大于1.5。
（3）重復(fù)性：用于評(píng)價(jià)連續(xù)進(jìn)樣中，色譜系統(tǒng)響應(yīng)值的重復(fù)性能。采用外標(biāo)法時(shí)，通常取各品種項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%；采用內(nèi)標(biāo)法時(shí)，通常配制相當(dāng)于80%,100%和120%的對(duì)照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進(jìn)樣2次，計(jì)算平均校正因子。其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。
（4）拖尾因子（T）?：用于評(píng)價(jià)色譜峰的對(duì)稱性。為保證分離效果和測(cè)量精度，應(yīng)檢查待測(cè)峰的拖尾因子是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定。
除另有規(guī)空外，峰高法定量時(shí)T應(yīng)在0.95～1.05之間。峰面積法測(cè)定時(shí)，若拖尾嚴(yán)重，將影響峰面積的準(zhǔn)確測(cè)量。必要時(shí)，應(yīng)在各品種項(xiàng)下對(duì)拖尾因子作出規(guī)定。
（三）測(cè)定法
（1）內(nèi)標(biāo)法：按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子側(cè)定用的對(duì)照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，
（2）外標(biāo)法：按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量對(duì)照品溶液和供試品溶液中待測(cè)成分的峰面積（或峰高）?，
由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)來(lái)用外標(biāo)法測(cè)定供試品中成分或雜質(zhì)含量時(shí)，以定量環(huán)或自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣為好。
（3）加校正因子的主成分自身對(duì)照法：測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，可采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法。在建立方法時(shí)，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質(zhì)對(duì)照品和待測(cè)成分對(duì)照品各適量，配制測(cè)定雜質(zhì)校正因子的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，按上述內(nèi)標(biāo)法計(jì)算雜質(zhì)的校正因子。此校正因子可直接載入各品種項(xiàng)下，用于校正雜質(zhì)的實(shí)測(cè)峰面積。這些需作校正計(jì)算的雜質(zhì)，通常以主成分為參照，采用相對(duì)保留時(shí)間定位，其數(shù)值一并載入各品種項(xiàng)下。
測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷?duì)照溶液，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度（以噪聲水平可接受為限）或進(jìn)樣量（以柱子不過(guò)載為限）?，使對(duì)照溶液的主成分色譜峰的峰高約達(dá)滿量程的10%～25%或其峰面積能準(zhǔn)確積分〔通常含量低于0.5%的雜質(zhì)，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）應(yīng)小于10%；含量在0.5%～2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于5%；含量大于2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于2%〕。然后，取供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，分別進(jìn)樣，供試品溶液的記錄時(shí)間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時(shí)間的2倍，測(cè)量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，依法計(jì)算各雜質(zhì)含量。
（4）不加校正因子的主成分自身對(duì)照法：測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，若沒(méi)有雜質(zhì)對(duì)照品，也可采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法。同上述加校正因子的主成分自身對(duì)照法配制對(duì)照溶液并調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度后，取供試品溶液和對(duì)照溶液適量，分別進(jìn)樣，前者的記錄時(shí)間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時(shí)間的2倍，測(cè)量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積并與對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算雜質(zhì)含量。若供試品所含的部分雜質(zhì)未與溶劑峰完全分離，則按規(guī)定先記錄供試品溶液的色譜32圖Ⅰ，再記錄等體積純?nèi)軇┑纳V圖Ⅱ。色譜圖Ⅰ上雜質(zhì)峰的總面積（包括溶劑峰）?，減去色譜圖Ⅱ上的溶劑峰面積，即為總雜質(zhì)峰的校正面積。然后依法計(jì)算。
（5）面積歸一化法：按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測(cè)量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計(jì)算各峰面積占總峰面積的百分率。
用于雜質(zhì)檢查時(shí)，由于峰面積歸一化法測(cè)定誤差大，因此，通常只用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量。除另有規(guī)定外，一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查。
發(fā)布于: 2025-04-09